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公众号：zyzhan
产品编号： EIA06720
使用前*阅读说明书。本酶联免疫试剂盒是基于经典酶联夹心技术原理，能测量大鼠TFR，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。
工作原理
TFR转铁蛋白受体，转铁蛋白受体是一种以非二硫键连接的跨膜糖蛋白，该蛋白由二个*相同的肽链组成，每条肽链的分子量为95KD。TfR-转铁蛋白-铁复合物通过细胞内吞泡的内在化途径由细胞膜进入细胞液。铁留在细胞液中，TfR-转铁蛋白复合物通过再循环返回到细胞表面。所提供的ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体也为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。
每套试剂盒中内容（96T）
材料 数量
标准品 96T（2vial）
预包被抗体的96孔板 96T（8×12）
生物素标记抗体 96T （1:100）
ABC（亲和素-过氧化物酶复合物） 96T （1:100）
样品稀释液 96T×2
抗体稀释液 96T×1
ABC稀释液 96T×1
TMB显色液A 96T×1
TMB显色液B 96T×1
TMB终止液 96T×1
ELISA洗涤液 96T×1（1:25）
需要而未提供的试剂和器材
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 自动洗板机。
4． 单通道或多通道可调节移液器以及其吸头。
5． 蒸馏水，容量瓶等
6． 干净的试管和Eppendof管。
注意事项
1． 从-20℃取出的试剂盒，在4℃解冻过夜。盒内每一瓶解冻的溶液在开启瓶盖之前都要轻轻摇匀，避免解冻时出现的分层，否则会出现浓度不均一的现象。
2． 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
3． 配制各种试剂时，切记混匀！
4． 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
5． 建议所有标准品、样本都做双份检测。
6． 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活！
7． 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品的准备和保存
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液，室温凝固2小时或4℃过夜，离心1000×g 10分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释的一般原则
用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的*检测范围。样品的稀释应有详细记录。
试剂的准备和保存
A. 标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液，*溶解后做倍比稀释。
稀释后的标准品在2小时内使用。
B．生物素标记抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素标记抗体加抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
D. TMB显色工作液的准备：在使用之前30分钟，按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比例配制TMB显色工作液。
操作程序
1． 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
2． 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3． 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5． 将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应zui长不要超过30分钟）。
10． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
操作程序总结：
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，37℃反应90分钟
洗板2次，加入生物素化抗体工作液，37℃反应60分钟
洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟
洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应
加入TMB终止液
30分钟之内读OD值
计算标本待测因子含量
检测范围：100 nmol/ml→1.5nmol/ml。
敏感性： ＜0.5 nmol/ml
特异性： 系统和其它因子无交叉反应。
保存： -20℃ [短期内（如两周）可4℃]
有效期： 12个月（-20℃）。
用途： 用于体外定量分析液体标本（通用型）。
REFERENCES
1. Nature 388:394-397（1997）.
2. Nat. Genet. 25:187-191（2000）.
3. Protein Sci. 13:2819-2824（2004）.
4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:588-593（1998）.
5. Nature 408:111-115（2000）.
6. J. Biol. Chem. 277:1845-1854（2002）.
7. J. Immunol. 173:3589-3593（2004）.
8. Cell 130:906-917（2007）.
9. Genetics 158:1657-1664（2001）.
10. Hum. Mol. Genet. 14:1449-1455（2005）..
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