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酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光学显微镜或电子显微镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。
酶标抗体的染色可分为直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一种抗体上，间接法是将酶标记在第2抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第l抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80％～90％的抗血清系由家兔制得，而绝大多数单克隆抗体系由小鼠制备）；第2抗体则为第1抗体[家兔和（或）小鼠的IgG]的抗体。所以，只要不同的第1抗体均来自同一种属，同一标记的第2抗体就能用来显示不同特异性抗原的存在，这样可避免直接法中标记每一种第1抗体的麻烦，并且提高了敏感度。目前的ICC染色中，以间接法应用zui广，在此着重介绍间接法的染色程序。
（1）切片准备：①石蜡切片经二甲苯脱蜡，再经不同浓度的乙醇溶液处理。②固定与未固定的新鲜组织冷冻切片，室温干燥2h以上。
（2）未固定的新鲜组织切片，经丙酮固定20—30min后，用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽，在室温下风干（15—30min）；已固定的组织冷冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。
（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。
（4）切片经PBS或其他缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冷冻切片上的包埋剂。但应用ALP标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。
（5）根据需要，用甲醇十0．3％H2O2处理切片15—30min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用ALP标记抗体时此步骤可省略。
（6）PBg漂洗2次，每次2min，移至0，05％Tween-20／PBS（或0．22％一1％TritonX-lOO）中5min（室温）。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的
显示。
（7）0．1％一1％BSA湿盒内孵育15～25min（室温）后，轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。
（8）滴加含0．2％BSA／0．05％NaN3／PBS稀释的第1抗体（抗体用量：每张切片一般为50～80P1），湿盒内孵育1～2h（20—25℃）。
（9）PBS充分冲洗（3次X 2rain），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第1抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。
（10）滴加含0．2％BSA／PBS稀释的HRP酶标记的第2抗体，20～25℃湿盒内孵育45—60min。
（11）PBS漂洗（3次X2min）。
（12）未固定或固定较弱的冷冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至Tris—HCl缓冲液（TBS）中，去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸钙而沉淀，然后用固定液固定5min
（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第1抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的ICC染色。
（13）呈色：HRP标记抗体的呈色液为0．01％一0．1％H202，0．01％一0．05％DAB和0．05—0．1mol／LWris—HCI（pH7．4）。切片经PBS或Tris—HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温，暗处），亦可在光学显微镜下控制显色速度，终产物为棕褐色沉淀。
（14）将切片置流水中，终止呈色反应。
（15）DAB呈色的标本可用系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其他物质呈色的标本在有机溶剂中沉淀物易溶解、褪色，用水溶性封固剂（如明胶甘油等）封固可使切片保存时间更长。
（16）显微镜检查，观察记录结果。
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